NAEEM RASHİD, SAİRA AKMAL, MUHAMMAD AKHTAR,
Türk Biyokimya Dergisi - 2011;36(2):107-115
Amaç: Çalışmanın amacı, Thermococcus kodakaraensis’den bir NADH oksidazın klonlanması ve Escherichia coli de ekspresyonu sonrası gen ürününün saflaştırılması ve ürün enzimin karakterize edilmesidir. Metotlar: NADH oksidaz geni klonlamış ve E. coli ekspresyon sisteminde eksprese edilmiştir. Rekombinant protein, ısı muamelesi ve iyon-değiştirici kolon kromatografisi vasıtasıyla saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Bulgular: Nikotinamit adenine dinükleotit oksidaz homologları, hipertermofilik arkea genomları içinde bulunmaktadır. Bu genomlar, TK0304, TK1299 ve TK1392 şeklinde tasarlanmış üç sekans halinde Thermococcus kodakaraensis KOD1 içinde bulunmaktadırlar. Biz bu çalışmada, TK1392 genini ve ürününü karakterize etmiş bulunmaktayız. TK1392 geni 1239 nükleotitden meydana gelmekte ve bu sekans, 413 amino asit zincirinden oluşan, molekül ağırlığı 45,244 Da olan bir polipeptit zincirini oluşturmaktadır. Proteinin izoelektrik noktası 8.73 bulunmuştur. TK1392 proteininin amino asit sekansı, diğer mikroorganizmalarla ve oluşturulmuş bir filogenetik ağaç içindeki homologlarıyla karşılaştırılmıştır. NADH oksidazın moleküler özelliklerinin araştırılması için TK1392 geni klonlanmış ve gen ürünü eksprese edilmiştir. Rekombinant proteinin molekül ağırlığı SDS-PAGE ile 45 kDa ve jel filtrasyon kromatografisi ile 90 kDa olarak bulunmuştur. Enzimin optimum pH’sı 7.0 ve optimum aktivite derecesi 75°C olarak bulunmuştur. Rekombinant enzimin NADH’a karşı Km değeri 35±3 μM ve spesifik aktivitesi 19.3 U mg-1 olarak bulunmuştur. Sonuçlar: Rekombinant TK1392, gerçek bir NADH oksidazdır ve dimerik formda bulunmaktadır. Enzim termostabildir ve yüksek bir NADH oksidaz aktivitesi göstermektedir.
